ARHI基因對胰腺癌微環境血管生成的影響及相關分子機制的研究

【摘要】胰腺癌是惡性程度最高的消化系統腫瘤之一,是西方國家第四大癌癥死亡原因；在我國,胰腺癌的發病率逐年上升,在所有腫瘤中居第7位。由于早期診斷困難,胰腺癌患者確診時約50%出現全身轉移；由于缺少有效治療手段,5年生存率僅6%,中位生存時間僅為4-6個月。腫瘤的生長和轉移與腫瘤血管生成密切相關,當腫瘤大小超過1～2mm3時,其繼續生長依賴于新生血管生成。研究發現多種信號分子參與腫瘤血管生成,其中CXCL8和VEGF是最重要的促血管生成因子,同時多種趨化因子和受體及相關信號通路的參與亦影響腫瘤血管生成。針對胰腺癌血管生成的研究將有利于發現胰腺癌治療的新靶點。ARHI基因是一個母源性印跡基因,是Ras超家族成員之一；與大部分Ras家族成員不同,ARHI基因是一個抑癌基因,其編碼的蛋白在人類多種組織中如卵巢、乳腺中表達,但在乳腺癌、卵巢癌中表達下調。北京協和醫院消化內科實驗室的前期研究發現,ARHI基因是胰腺癌抑癌基因,可以抑制胰腺癌細胞的增殖、促進細胞周期停滯、誘導細胞凋亡及自噬發生和抑制細胞遷移。ARHI基因是胰腺癌發生發展重要抑癌基因,然而腫瘤細胞的生長和轉移受到微環境的調控,而在這種調控中血管生成是重要的關鍵環節,并且是目前和未來治療的重要靶點。因此探討ARHI基因對胰腺癌腫瘤血管生成的調控作用及其機制有重要意義,目前尚未見報道。本研究目的：通過人胰腺癌組織、胰腺癌細胞株、裸鼠胰腺癌荷瘤,探討ARHI基因對胰腺癌血管生成的影響及相關機制,探討ARHI基因對腫瘤微環境中趨化因子和受體的影響及意義。為進一步研究胰腺癌發病機制和抗腫瘤血管生成治療在胰腺癌中的應用,提供重要的理論依據。第一部分ARHI基因對人胰腺癌組織血管生成的影響及其相關臨床與病理意義目的：探討ARHI基因與胰腺癌組織血管密度、血管生成相關蛋白和臨床與病理的相關性方法：1.收集23例胰腺癌組織和27例正常胰腺組織標本,登記臨床病理資料。2.應用免疫組化方法檢測ARHI、CD34、VEGF和CXCL8蛋白在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達。3.分析各蛋白表達和胰腺癌臨床與病理因素的關系。4.分析ARHI與MVD、VEGF、CXCL8四者之間的相互關系。結果：1.ARHI蛋白在正常胰腺組織和胰腺癌組織中表達的陽性率分別為88.9%和21.7%,兩者有顯著差異；正常胰腺組織MVD值顯著低于胰腺癌組織,分別為27.84±2.01和43.47±6.44；正常胰腺組織VEGF蛋白表達陽性率(44.4%)顯著低于胰腺癌組織中VEGF(100%),兩者比較有顯著統計學差異；CXCL8蛋白在正常胰腺組織和胰腺癌組織中表達的陽性率分別為44.4%和100%,兩者比較有顯著統計學差異。2.ARHI的表達與腫瘤分化程度呈相關性,腫瘤分化程度越低,ARHI表達缺失率越高；CXCL8的表達與CA199水平呈相關性,CA199水平越高,CXCL8陽性表達率越高,與腫瘤分化程度呈相關性,腫瘤分化程度越低,CXCL8陽性表達率越高；VEGF的表達與年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、血清CA199水平、血清CA242水平、臨床分期、分化程度、腫瘤大小、腫瘤位置、淋巴結轉移、血管浸潤均無相關性。3.胰腺癌中MVD與CXCL8的表達呈正相關,MVD與VEGF、CXCL8與VEGF、ARHI與MVD、ARHI與VEGF、ARHI與CXCL8的表達均無顯著相關性。4.在所有統計病例中,CXCL8與VEGF的表達呈正相關,ARHI與MVD、VEGF及CXCL8的表達呈負相關。小結：1)在胰腺癌組織中,ARHI表達缺失或顯著下調,MVD值顯著增多,VEGF和CXCL8表達顯著上調。2)ARHI、VEGF和CXCL8與腫瘤分化程度相關；MVD與血清CA199水平、臨床分期、分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移均呈正相關。3)在所有統計病例中,CXCL8與VEGF的表達呈正相關,ARHI與MVD、VEGF及CXCL8的表達呈負相關。第二部分胰腺癌細胞株和裸鼠胰腺癌荷瘤驗證ARHI基因對腫瘤血管生成的影響及相關機制的初探目的：探討ARHI基因對胰腺癌血管生成的影響及相關機制。方法：1.應用攜帶ARHI基因的質粒pIRES2-ARHI-EGFP和pLNCX2-ARHI-EGFP,采用脂質體瞬時轉染胰腺癌PANC-1細胞系,并用G418篩選建立穩定轉染的多克隆細胞株。2.驗證ARHI基因表達情況,用MTT法檢測ARHI基因對胰腺癌細胞增殖的影響。3.通過Real-timePCR和Westernblot檢測胰腺癌細胞株中ARHI基因轉染對mTOR、SOSC3、Stat3、NF-κB、VEGF、CXCL8mRNA和(或)蛋白表達的影響。4.將ARHI穩定轉染PANC-1細胞株、空載體穩定轉染PANC-1細胞株和未轉染PANC-1細胞株接種于裸鼠腋窩皮下,比較三組裸鼠體重變化、腫瘤重量和體積。5.荷瘤標本一部分進行病理學檢測,通過免疫組化檢測ARHI、Ki-67、CD34、VEGF、CXCL8蛋白的表達；一部分標本通過Real-time驗證ARHI基因對mTOR、SOSC3、Stat3、NF-κB、VEGF、CXCL8mRNA表達的影響。結果：1.G418篩選4周收集穩定轉染胰腺癌細胞,通過RT-PCR和Westernblot方法檢測,在ARHI基因穩定轉染組可見ARHImRNA和蛋白表達,而空載體和對照組無表達。2.慢病毒質粒pLNCX2-ARHI-EGFP轉染效率高,熒光更強,用于后續實驗。3.MTT結果顯示,pLNCX2-ARHI-EGFP組穩定轉染多克隆細胞株比pLNCX2-EGFP組穩定轉染細胞株增殖緩慢。4.pLNCX2-ARHI-EGFP組mTOR、Stat3、NF-κB、VEGF、CXCL8mRNA表達比pLNCX2-EGFP組顯著降低,SOCS3mRNA表達顯著升高；p-mTOR、p-Stat3、NF-κB、CXCL8蛋白表達顯著降低。5.接種后所有裸鼠均有一定程度的消瘦,pLNCX2-ARHI-EGFP組消瘦顯著,腫瘤質量和體積顯著偏小。6.pLNCX2-ARHI-EGFP組裸鼠荷瘤中ARHImRNA和蛋白表達陽性,pLNCX2-EGFP組和對照組無表達,證明胰腺癌荷瘤成功建立。7.pLNCX2-ARHI-EGFP組裸鼠荷瘤中Ki-67蛋白表達顯著下降,MVD顯著減少,VEGF和CXCL8蛋白表達顯著下降。8.pLNCX2-ARHI-EGFP組裸鼠荷瘤中mTOR、Stat3、NF-κB、VEGF、CXCL8mRNA表達顯著下降,SOCS3mRNA表達顯著升高,與細胞結果一致。小結：1)成功構建穩定表達ARHI基因的多克隆PANC-1細胞株。2)ARHI基因再表達可以抑制胰腺癌細胞的增殖。3)通過裸鼠胰腺癌荷瘤的建立,在動物水平驗證了ARHI基因對胰腺癌生長及腫瘤血管生成的抑制作用。4)ARHI基因抑制胰腺癌細胞和裸鼠荷瘤中VEGF、CXCL8的表達,ARHI基因可能通過mTOR/NF-KB和STAT3信號通路途徑抑制CXCL8和VEGF的表達,進而抑制胰腺癌血管生成。第三部分ARHI基因對胰腺癌細胞中血管生成相關趨化因子和受體表達的影響目的：探討ARHI基因通過對腫瘤微環境中趨化因子和受體的作用,對胰腺癌生長、侵襲轉移、免疫和血管生成的影響。方法：1.通過Real-timePCRArray檢測穩定轉染ARHI基因對84個趨化因子和受體mRNA表達水平的影響。2.挑選與腫瘤血管生成相關的趨化因子和受體,設計引物在ARHI基因穩定轉染細胞株和胰腺癌裸鼠荷瘤中進行驗證。結果：1.PCRArray結果：1)pLNCX2-ARHI-EGFP組中有36個基因mRNA表達下調,9個基因mRNA表達上調；2)與腫瘤血管生成相關基因：促腫瘤血管生成基因中,CCL2、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL12和CXCR4表達顯著下調,CXCL3、CCR1和CCR2表達輕度下調；抗腫瘤血管生成基因中,CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCR3表達顯著上調,以CXCL9最明顯,達27.8倍；3)與腫瘤轉移和侵襲相關基因：CXCL12和CXCR4表達顯著下調,MMP-2表達輕度下調；與對遠端器官定位浸潤和潛伏相關基因：CXCL12、CXCR4和CCR7表達顯著下調,CXCR5表達輕度下調；與腫瘤免疫調節相關基因：CXCL8、CXCR1和CCR7表達顯著下調,其中以CXCR1尤為明顯,達-41.3倍。2.驗證結果顯示,pLNCX2-ARHI-EGFP組較pLNCX2-EGFP組CXCL8、CXCL1和CXCR4mRNA表達顯著下降,CXCR3mRNA表達顯著上調,與PCRArray結果一致；CXCR2表達顯著下降。3.pLNCX2-ARHI-EGFP組裸鼠荷瘤較pLNCX2-EGFP組裸鼠荷瘤中CXCL8、CXCL1、CXCR4和CXCR2mRNA表達顯著下降,CXCR3mRNA表達顯著上調,與細胞結果一致。小結：ARHI基因影響胰腺癌細胞趨化因子和受體的表達,提示ARHI基因抑制胰腺癌生長作用部分通過趨化因子及其受體調節腫瘤微環境的血管生成和免疫而實現的。結論：1.ARHI在78.3%胰腺癌組織中表達缺失或下調,再次驗證ARHI基因是胰腺癌抑癌基因。而ARHI蛋白表達與MVD、VEGF及CXCL8蛋白表達呈負相關。2.ARHI基因抑制胰腺癌細胞株增殖,抑制胰腺癌裸鼠荷瘤的生長,抑制胰腺癌裸鼠荷瘤中血管生成和相關蛋白VEGF和CXCL8的表達。3.ARHI基因抑制腫瘤中血管生成和相關蛋白VEGF和CXCL8可能通過mTOR/NF-KB和STAT3信號傳導通路,進而抑制胰腺癌血管生成。4.ARHI基因促進或抑制腫瘤微環境中多種趨化因子和受體,進而影響胰腺癌生長和轉移。
【作者】胡珊珊；
【導師】錢家鳴；
【作者基本信息】北京協和醫學院，內科學，2014，博士
【關鍵詞】ARHI；胰腺癌；VEGF；CXCL8；腫瘤血管生成；趨化因子；受體；

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