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調節NMD通路中SMG5的miR-433的鑒定及miRNA-NMD-作用底物調控通路的初步研究
【摘要】在真核細胞的進化過程中形成許多mRNA質量監控機制來實現基因的準確表達,其中無義介導的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是一種重要的轉錄后監控機制,可識別含提前終止密碼子(prematureterminationcodons,PTC)的異常mRNA并對其進行降解,有效避免產生的截短蛋白對細胞的毒害。其中,SMG5在NMD中扮演著重要的角色,SMG5是一個編碼蛋白基因,沒有核糖核酸酶活性,但對逆轉錄酶的活性有促進作用,它和SMG7一起被認為與涉及核酸外切途徑的mRNA降解機制存在聯系—通過招募磷酸酯酶2A(PP2A)引起UPF1的脫磷酸化。microRNA(miRNA)是一類長度約為19-24nt內源性保守單鏈非編碼小分子RNA。miRNA通過與靶基因mRNA的3’UTR特異互補結合,在轉錄后水平上調節靶mRNA的表達或者阻止蛋白的翻譯,目前研究表明,miRNA參與了許多生理及病理的過程,例如,參與了腫瘤的發生發展和轉移、細胞凋亡、細胞增殖和分化的生物化學過程等。但是目前有關miRNA參與NMD通路的報道比較少,因此,作用于NMD通路中的主要因子的miRNAs是不是介導mRNA的降解是一個值得研究的課題,本試驗以NMD通路中的關鍵因子SMG5為研究對象,通過生物信息學的方法篩選出潛在的以SMG5為靶基因的miR-433。并利用分子生物學方法研究二者的作用關系,以及在NMD通路中所發揮的作用。主要的研究結果如下：(1)生物信息學預測潛在調控SMG5的miRNAs。利用生物信息學軟件TargetScan等對作用于SMG53’UTR的miRNA進行預測,結果得到了多個miRNAs,經過篩選最終確定miR-433作為研究對象。(2)組織表達譜的構建。利用實時定量PCR技術檢測miR-433和SMG5在小鼠心、肝、腎等十二種組織的表達量,并繪制了組織表達譜。結果顯示：SMG5基因在小鼠組織中廣泛表達,miR-433在腦和肌肉中表達量較高。(3)雙熒光素酶報告基因的檢測。根據miR-433與SMG5基因的3’UTR結合序列,構建了野生型和突變型熒光素酶報告基因pmirGLO載體。并將這兩種質粒分別與miR-433mimic和miR-433inhibitor共轉入HEK-293T細胞、Hela細胞,檢測相應的熒光活性,結果表明：miR-433與SMG5之間存在負調控的關系。(4)miR-433調控SMG5的表達檢測。miR-433mimic轉染BHK細胞后,利用RT-PCR和Westernblot檢測SMG5的表達量,結果發現：SMG5的mRNA表達量顯著下降(P<O.01),miR-433也降低了SMG5蛋白水平；而將miR-433inhibitor轉染C2C12細胞后,得到的結果剛好相反,SMG5的表達量顯著上升(P<O.01),miR-433inhibitor上調了SMG5的蛋白水平。(5)利用熒光定量PCR和westernbolt檢測miR-433調控SMG5底物基因GADD45B.TBL2的表達。將miR-433mimic轉染細胞后,利用熒光定量PCR和westernbolt檢測NMD中SMG5底物基因TBL2、GADD45B的表達,結果顯示：miR-433上調了TBL2、GADD45B的表達,進一步推斷miR-433參與NMD通路。(6)干擾SMG5對底物基因的影響。利用SMG5基因的siRNA,轉染C2C12細胞,實時熒光定量PCR檢測SMG5被干擾后底物基因TBL2、GADD45B的表達量,結果顯示：干擾24h后,SMG5表達量較對照組顯著下降(P<0.01),而TBL2、GADD45B則有不同程度的上升(P>0.05)；進行Westernbolt試驗,所得的結果與此相符。從以上結果,我們推斷miR-433能夠通過抑制SMG5的表達參與NMD通路。
【作者】張芳；
【導師】任竹青；
【作者基本信息】華中農業大學，動物遺傳育種與繁殖，2014，碩士
【關鍵詞】無義介導的mRNA降解；SMG5；miRNA-433；GADD45B；TBL2；

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兔短鏈脂肪酸受體GPR41和GPR43基因的鑒定
【摘要】短鏈脂肪酸,主要包括乙酸、丙酸和丁酸,主要由腸道微生物發酵沒有被消化和不能被消化的碳水化合物生成。短鏈脂肪酸不僅是動物體內重要的能量來源(可提供牛60%-70%的能量需要,豬15%-24%的能量需要),而且是重要的信號分子,在很多生理過程中發揮重要的調節作用。2003年,有研究表明短鏈脂肪酸能夠激活G蛋白偶聯受體GPR41和GPR43,并且GPR41和GPR43與短鏈脂肪酸結合對機體代謝、免疫等功能具有潛在的調控作用。迄今,關于GPR41和GPR43的研究主要集中在人、大鼠和小鼠上,對于兔基因組中是否含有GPR41和GPR43基因及其結構、功能和組織表達情況尚未有研究報道。本研究,首先確定兔全基因組中是否含有與人和嚙齒類動物GPR41和GPR43基因序列相似的基因。然后檢測GPR41和GPR43基因是否在兔的各個組織中表達。若表達,通過巢式PCR法和蛋白印跡法分別在基因水平和蛋白水平檢測兔各組織中GPR41和GPR43的表達情況。1利用BLAST和DNAMAN等進行序列分析運用BLAST對比兔的基因組與人、大鼠、小鼠、牛和山羊的GPR41基因和GPR43基因。結果表明：兔的基因組含有GPR41和GPR43基因,且兔GPR41基因序列與人大鼠、小鼠、牛、和羊的GPR41基因序列的相似性分別為84%、80%、81%、84%和84%；兔GPR43基因序列與人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR43基因序列的相似性分別為83%、85%、84%、79%和81%。氨基酸序列對比,結果表明：GPR41氨基酸序列與人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR41氨基酸序列的相似性分別為70%、75%、75%、74%和74%；GPR43氨基酸序列與人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR43氨基酸序列的相似性分別為79%、81%、82%、72%和73%。2巢式PCR檢測兔各組織中GPR41和GPR43mRNA的表達采用巢式PCR技術,分別分析GPR41和GPR43基因在兔不同組織內]mRNA水平。結果表明：GPR41基因在除了下丘腦和垂體外的各組織中都有表達,在肝臟、結腸和脂肪組織中表達量較高；肌肉和心臟組織表達量較少。GPR43基因在各組織中均有表達,在下丘腦和脂肪組織中表達量較高；肌肉和腎上腺組織表達量較少。3蛋白印跡法檢測兔各組織中GPR41和GPR43蛋白表達水平利用western-blot技術,分別檢測兔不同組織中GPR41和GPR43蛋白的表達水平。結果表明：GPR41在除了下丘腦和垂體組織外的其他組織中均有表達,在肝臟組織中表達量較高,實驗檢測出的蛋白大小在55kD-70kD之間,大于GPR41目的蛋白39kD;GPR43在兔的組織中均有表達,在肌肉和肺組織中表達量較高,實驗檢測出的蛋白大小在55kD-70kD,大于GPR43目的蛋白43kD。
【作者】蘇浩；
【導師】姚文；
【作者基本信息】南京農業大學，養殖，2013，碩士
【關鍵詞】兔；GPR41；GPR43；mRNA表達；蛋白表達；

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加權基因共表達網絡分析（WGCNA）在食管鱗癌中的應用
【摘要】食管鱗狀細胞癌(Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)是我國常見的惡性腫瘤,其五年生存率不到25%,復發和轉移是導致ESCC病人死亡和預后不良的主要原因。ESCC的發生發展是一個多基因參與、多因素作用、多階段進展的復雜的生物學過程,它依賴于多種基因、轉錄本、蛋白質的相互作用及調控。深入研究ESCC的分子機制是提高ESCC診治效果的基礎。傳統的生物學研究以單個基因、轉錄本和蛋白質的具體功能及特點為基礎,盡管這種研究方法對在分子水平上揭示生命機制起著重要的作用,但不可否認其僅能對生物系統的局部作出解釋,無法對生物系統的整體行為進行更為深入和全面的探索。生物網絡可直觀地展現生物系統中各個功能元件之間的相互關系,為研究生物體在系統水平的特征提供了重要的平臺。加權基因共表達網絡分析(Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis,WGCNA)利用了系統生物學的思想尋找基因之間表達的相似性,并將表達高度相關的基因確定為一個基因模塊。本研究將WGCNA用于ESCC表達譜數據的分析。我們使用ESCC腫瘤組織與癌旁正常組織中差異表達的基因作為WGCNA的數據源進行分析,共得到8個與上皮細胞分化、細胞外基質重構、細胞周期等GO分類密切相關的基因模塊。接著,我們選擇一個獨立隊列的ESCC表達譜數據來驗證WGCNA分析得到的基因模塊,發現大多數的模塊在不同數據來源的ESCC隊列中具有一致性,這結果表明我們的分析方法準確且具有可重復性。最后我們聯合分析基因模塊與臨床信息,找到一系列與腫瘤分級、病人生存時間、腫瘤分期等相關的基因模塊。加權通過進一步分析基因模塊結構,我們得到一系列與腫瘤分級高度相關且在模塊中具有高連接度的樞紐基因,這些基因對ESCC的發生發展具有潛在的重要作用。我們的結果表明WGCNA能夠發現具有生物學意義的基因模塊,且通過聯合臨床信息分析所發現的樞紐基因也與文獻報道基本吻合,這也證明WGCNA分析基因芯片數據的準確性和有效性。這是WGCNA方法第一次被用于分析ESCC數據,對基因模塊信息的進一步挖掘有助于我們更深入地研究關鍵基因、關鍵信號通路、基因之間的調控機制對于腫瘤發生發展的作用和意義。
【作者】王攀；
【導師】赫捷；
【作者基本信息】北京協和醫學院，臨床醫學，2014，博士
【關鍵詞】食管鱗癌；基因共表達網絡；腫瘤分級；加權基因共表達網絡分析；

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